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（1）樣本處理與培養(yǎng)

根據(jù)Legiolert說(shuō)明書進(jìn)行。在無(wú)菌微管中加入1mL Legiolert 預(yù)處理液及1 mL樣品，渦旋混勻后室溫下溫育1 min，轉(zhuǎn)移至100 mL 溶解的Legiolert試劑中，充分混合并倒入Legiolert 量盤，用SealerPlus 程控定量封口機(jī)密封。

將密封好的Legiolert定量盤紙側(cè)向下置于(37±0.5)℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d。7 d后，定量盤中棕色孔或渾濁孔即為陽(yáng)性孔。

（2）陽(yáng)性孔確證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)酶底物法的特異性，對(duì)Legiolert定量盤中陽(yáng)性孔進(jìn)行確證試驗(yàn)。Legiolert定量盤共有6個(gè)大孔，90個(gè)小孔。如果陽(yáng)性孔數(shù)小于10個(gè)，全部進(jìn)行確證；如果陽(yáng)性孔數(shù)大于10個(gè)，先選取10個(gè)(包括全部大孔及隨機(jī)選取的小孔)，再加上隨機(jī)選取剩余陽(yáng)性孔數(shù)的 25%進(jìn)行確證。確證方法為使用無(wú)菌注射器抽取10 μL懸浮液，涂布BCYE和L-半胱氨酸缺失的 BCYE，35 ~ 37 ℃培養(yǎng)48 ~ 72 h,在BCYE上生長(zhǎng)、L-半胱氨酸缺失的BCYE 上無(wú)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行生化鑒定、血清型別鑒定及real-timePCR 鑒定。

(3)酶底物法的計(jì)量結(jié)果

酶底物法采用MPN法確定樣本中嗜肺軍團(tuán)菌含量，計(jì)算陽(yáng)性大孔和小孔的數(shù)目，并從 LegiolertMPN 表獲得所得MPN值。MPN是應(yīng)用概率理論來(lái)估算細(xì)菌濃度，實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn)，MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率大的一點(diǎn)。